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Qué no se qué es una PCR....
Muy resumidamente:
Sé que en la realización de una RT-PCR primero hay que extraer el ARN del material. Luego hay que hacer una conversión a ADN complementario y por último hay multiplicar ese ADN con la PCR. Y todo esto hay que hacerlo antes de la secuenciación del material genético que es una técnica separada de dicha PCR.
Para establecer el inicio y el fin de la secuencia ("Diana") que se quiere multiplicar se utilizan los iniciadores o cebadores (Primers en inglés) . Los cebadores son suficientes para generar el ADN amplificado que después se puede
detectar con un tinte, un colorante fluorescente no específico.
Luego tenemos las sondas o "Probes" que se utilizan en el caso de que el ensayo tnga como objetivo un diagnóstico ya que al ser las que emiten la fluorescencia cuando la polimerasa hace la reacción son más fiables porque hacen que el test sea más especifico, o lo que es lo mismo, que los cebadores no se unan a otras cosas que no nos interesan.
Si la finalidad del ensayo no es el diagnóstico no es necesario utilizar las probes ya que hacen que dicho ensayo sea más caro. ¿Voy bien?
Sé que cada laboratorio utiliza sus propios reactivos que exigen unos determinados ciclos de amplificación que van produciendo una determinada cantidad de ADN que se mide como he dicho por Fluorescencia. Dicha fluorescencia va aumentando en cada ciclo a medida que se va produciendo ese ADN y que en la PCR en tiempo real (la otra RT) puedes ir viéndolo en la pantalla con una curva que va creciendo a medida que la reacción avanza y se va generando más producto.
Sé que sino aciertas con los ciclos el resultado puede ser erróneo y que esto también depende del tipo de sonda utilizada. Sé que si empleas un alto número de ciclos (un Cq por encima de unos 35) la PCR te dará positivo a cualquier cosa.
Además es completamente dependiente de los instrumentos, los reactivos y las sondas.
Por eso según cómo se realice la RT-PCR se pueden obtener resultados muy distintos. Depende de cómo se preparen las muestras, qué enzimas de RT se utilicen, qué protocolos se empleen y cómo se interpreten los datos obtenidos.
En todos los pasos de la RT-PCR hay muchos problemas que alteran completamente el resultado final, y ya no digamos si se quiere ver la carga viral, no solo un "si" o "no".
Si quieres hablamos de los problemas que hay en cada paso del proceso.Y después me vas a decir que no hay errores en la técnica de la PCR.... Jajajaja.
Entramos si quieres al detalle. Es un tanto complejo pero como tu ya lo dominas... ¿Qué te parece?.
¡Un aplauso!.
